Obesidad y monocitos macrófagos en el tejido adiposo / Adipose tissue monocytes and macrophages in obesity

Introducción: el tejido adiposo ha sido objeto de estudio en las últimas décadas y existen nuevos conceptos de su compleja biología. Se conoce que la obesidad está asociada con un estado inflamatorio crónico de bajo grado tanto local como sistémico y parece desempeñar un papel clave en las consecuencias del aumento en diferentes comorbilidades metabólicas y vasculares. Discusión: de los diversos tipos de células inmunes que contribuyen a la inflamación inducida por la obesidad, los monocitos/macrófagos en el tejido adiposo juegan un papel central. Las modificaciones estructurales y fenotípicas de ambas células pueden contribuir no solo a alteraciones inflamatorias y metabólicas, sino también ayudar a mantener la homeostasis del tejido adiposo en respuesta al aumento de la grasa corporal. Los macrófagos son células efectoras esenciales en la organización de la inflamación, ya que se cree que promueven la progresión de la obesidad y los trastornos relacionados. No está completamente establecido si dichas células ejercen un papel beneficioso o nocivo en el tejido adiposo. En cualquier caso, su presencia modifica la biología de las células adiposas especializadas. Conclusiones: en esta revisión se analiza el conocimiento sobre la contribución de los monocitos/macrófagos dentro del tejido adiposo en el desarrollo y mantenimiento de la obesidad y las complicaciones potenciales relacionadas.

Evaluación del efecto inmunomodulador de Bougainvillea xbuttiana (var. naranja) sobre la producción de citoquinas de macrófagos inducida pelo veneno de Bothrops jararaca

To study the effect of 50% ethanol extract of Bougainvillea xbuttianaon the enzymatic activity, cell viability and cytokine production provoked by the venom of Bothrops jararacain macro-phages. Three assays were used to study the effects of B. xbuttianaextract on the damage pro-duced by B. jararaca: Enzymatic activity was detected by measuring the proteolytic and phos-pholipase A2; macrophages cytotoxicity was determined by the MTT method; levels of cytokine were evaluated using ELISA and a biological assay. After treatment with 300 μg/mL B. xbuttianaextract for 30 min, the proteolytic and phospholipase A2activities of the venom were reduced to 95 and 61%, respectively. In macrophages cultures treated with B. xbuttianaextract combined with venom, the production of TNF-α, IL-6 and IFN-γ was reduced, whereas IL-10 was potenti-ated. Our results support the potential effect of the B. xbuttianaextract as a complementary therapy against the toxicity caused by the venom of B. jararacasnakes.

The protective effect of gamma aminobutyric acid B receptor activation on sympathetic nerve remodeling via the regulation of M2 macrophage polarization after myocardial infarction.

INTRODUCTION & OBJECTIVES: Acute myocardial infarction (AMI) in coronary heart disease is a leading cause of sudden death primarily due to malignant ventricular arrhythmias (VAs). Inflammatory cell infiltration and inflammation-induced overactivation of sympathetic nerves are the major cause of VAs in AMI pathophysiological processes. Type 2 macrophages play an anti-inflammatory role in AMI. Targeting macrophages may be a therapeutic strategy to prevent VAs post AMI. We found that gamma aminobutyric acid (GABA) promotes macrophages polarized to M2 and hypothesized that GABA might exert anti-inflammatory effects by promoting type 2 macrophage polarization in AMI. We aim to characterized GABAB receptor distribution, function, and mechanisms in M2 macrophage polarization and explored the functional aspect of GABAB receptor activation in sympathetic remodeling. RESULTS: Gamma aminobutyric acid B receptors were expressed on macrophage surface both in vitro and in vivo. GABAB receptor agonist baclofen, GABA promoted macrophage switch to M2. While GABAB receptor antagonist CGP52432 blocked a baclofen induced switch to M2 polarization. GABA and baclofen increased M2 macrophage percentage and CGP52432 blocked this process in vivo. Also, IL-10 and TGF-ß1 released by M2 were increased in both AMI and baclofen/AMI group; Serum NE levels were decreased by baclofen. All the above effects were reversed by CGP52432 treatment. Baclofen decreased TH and GAP-43 staining while CGP52432 enhanced their expression post AMI indicating GABAB receptor activation inhibited sympathetic nerve sprouting and activity by reducing NE release. CONCLUSIONS: Gamma aminobutyric acid B receptor activation promoted M2 polarization and protested AMI heart by regulating sympathetic nerve remodeling.

Efeito da migalina sobre a resposta inflamatória provocada por monofosforil lipídio A (MFLA), agonista de TLR4, na linhagem Raw 264.7

Macrophages are important cells of the immune system that play a role in innate and adaptive immune responses. They can differentiate into M1 and M2 subpopulations that display distinct functions in response to different stimuli. Toll-like receptors are fundamental in recognizing molecules associated with pathogens, as they activate macrophages and the innate immune response. The use of toll-like receptor activating molecules has been studied as a potential for new adjuvants, among these molecules Monophosphoryl lipid A (MPLA) stands out, a detoxified derivative of Lipid A, the main component of LPS (TLR4 agonist). Mygalin is a synthetic acylpolamine, analogous to the spermidine polyamine, originating from hemocytes of the spider Acanthoscurria gomesiana. This molecule has proven microbicide activity and does not cause cytotoxicity in eukaryotic cells. Mygalin binds to E. coli LPS and regulates the overproduction of pro-inflammatory cytokines in response to LPS. MPLA is one of the detoxified LPS subunits and has been used as an adjuvant. We investigated, using in vitro assays, the immunomodulatory character of Mygalin on the inflammatory response induced by the activation of macrophages of the Raw 264.7 cell line in response to MPLA, to define the contribution of this subunit in the suppression of the response to LPS. LPS and IFN-γ were used in parallel and possible mechanisms of this immune regulation were explored. We investigated, using in vitro assays, the immunomodulatory character of Mygalin on the inflammatory response induced by the activation of macrophages of the Raw 264.7 cell line in response to MPLA, to define the contribution of this subunit in the suppression of the response to LPS. LPS and IFN-γ were used in parallel and possible mechanisms of this immune regulation were explored. Our results showed that Mygalin did not induce NO synthesis in macrophages stimulated with both MPLA and LPS and suppressed the synthesis of cytokine IL-6 and chemokine CCL2 in cells stimulated with these TLR4 agonists. The contribution of the arginase activation pathway in NO suppression was also evaluated using NOHA as an inhibitor, the direct action of this enzyme in reducing NO synthesis was not proven.

Os macrófagos são importantes células do sistema imunológico que atuam na resposta imune inata e adaptativa. São capazes de se diferenciar em subpopulações M1 e M2 que apresentam funções distintas em resposta a diferentes estímulos. Os receptores Toll-like são fundamentais no reconhecimento das moléculas associadas aos patógenos, pois ativam os macrófagos e a resposta imune inata. O uso de moléculas ativadoras de receptor toll-like tem sido estudado como potencial de novos adjuvantes, dentre essas moléculas destaca-se o Monofosforil lipídeo A (MFLA), um derivado desintoxicado do Lipídio A, o principal componente do LPS (agonista de TLR4). A Migalina é uma acilpoliamina sintética, análoga da poliamina espermidina, originária de hemócitos da aranha Acanthoscurria gomesiana. Esta molécula possui comprovada atividade microbicida e não provoca citotoxicidade nas células eucarióticas. A Migalina se liga ao LPS de E. coli e regula o excesso de produção de citocinas pro-inflamatória em resposta ao LPS. O MFLA é uma das subunidades detoxificada do LPS, e vem sendo usado como adjuvante. Neste trabalho investigamos em ensaios in vitro o caráter imunomodulador da Migalina sobre a resposta inflamatória induzida pela ativação de macrófagos de linhagem celular Raw 264.7 em resposta ao MFLA, para definir a contribuição desta subunidade na supressão da resposta ao LPS. Foi usado paralelamente LPS e IFN-γ e explorado possíveis mecanismos desta regulação imune. Nossos resultados mostraram que a Migalina não induziu a síntese de NO em macrófagos estimulados tanto com MFLA quanto LPS e suprimiu a síntese da citocina IL-6 e da quimiocina CCL2 em células estimuladas com estes agonistas de TLR4. Foi também avaliado a contribuição da via de ativação da arginase na supressão de NO usando o inibidor NOHA, não sendo comprovada a ação direta desta enzima na redução da síntese de NO.

Reprogramação metabólica e de função do macrófago por crotoxina

Macrophages (MØ) are cells with high plasticity that can be reprogrammed into two distinct phenotypes – MØ M1 (pro-inflammatory) and MØ M2 (pro-resolving) – according to the nature of the disorder detected in the organism. Experimentally, it is already possible to induce the reprogramming of macrophages to M1 and M2 and the functional and metabolic status of both phenotypes have already been characterized. Previous studies by our group have shown that Crotoxin (CTX) exerts two actions on macrophages that make them suitable in cell therapy: 1) it alters their metabolic and functional profile and 2) these effects are long-lasting. Such effects are observed after a single, short exposure to the toxin. In this context, this research sought to characterize the metabolism and functional status of MØ treated with different concentrations of CTX, with the aim of verifying whether in each concentration it is possible to identify different phenotypes and activation states of the already identified M1 and M2 profiles, in order to seek to reprogram these cells according to specific pathophysiological processes. The capacity for phenotypic reprogramming of monocytes induced by CTX was evaluated in in vitro assays, using cells of the human monocytic lineage (THP-1), previously incubated with RPMI medium (control), or LPS (1ug/mL) or tumor conditioned medium of MCF7 cells (MCT) for 48 hours. Subsequently, they were incubated in the absence (control) or presence of CTX at different concentrations (2 nM; 10 nM; 50 nM and 100 nM) for 1 hour. After the different incubation protocols with the toxin, the differentiation and phenotype markers were analyzed using the qPCR technique, and the latter were also analyzed using flow cytometry. To evaluate the effects of treatments on cellular functions, the phagocytosis capacity, the generation of reactive oxygen species (H2O2) and the production of cytokines by MØ were observed. Cellular metabolism was evaluated through gene expression and activity of key enzymes of the glycolytic pathway. The data presented show that THP-1 cells are satisfactorily differentiated by LPS (1 µg/mL) and tumor environment-MCT (vol. obtained from 1x106 /mL) and these cells have their functions modulated distinctly by CTX, depending on the concentration used. CTX had a dual action on the functions of these human macrophages, since it induced phagocytosis activity, while at the same time stimulated the production of H2O2 in control cells. However, these effects vary depending on the microenvironment stimuli, since, in a tumor and inflammatory context, phagocytosis was preserved in a concentration-dependent manner, concomitant with the increase in H2O2 release in some concentrations. Regarding the metabolic pathways, the undifferentiated THP-1 cells did not show alteration in the gene expression of any of the evaluated glycolytic enzymes, under the effect of any concentration of CTX, suggesting that the toxin does not modulate the expression of these enzymes in the THP-1 cell in monocyte condition. However, when stimulated by LPS and MCT, CTX modulated the gene expression of some enzymes: the 50 nM concentration increased the expression of enzymes from metabolic pathways that are more active in M1 (PFK, FAS and citrate synthase) and also reduced the activity of the enzyme CPT-1 (lipolysis), wich hight activity is related to M2. These effects were accompanied by an increase in pro-inflammatory cytokines. In the inflammatory environment (LPS) the concentration of 10 nM of the toxin promoted a concomitant positive marking of both M1 and M2 markers. Also, at 100 nM CTX promoted parallel release of pro- and anti-inflammatory cytokines. Taken together, the results allow us to state that CTX modulates functions and bioenergetic pathways of human macrophages, depending on the concentration used and the microenvironment stimulus involved.

Os macrófagos (MØ) são células com alta plasticidade que podem ser reprogramados em dois fenótipos distintos – MØ M1 (pró-inflamatórios) e MØ M2 (pró-resolutivos) – de acordo com a natureza do distúrbio detectado no organismo. Experimentalmente, já é possível induzir a reprogramação de macrófagos a M1 e M2 e o estado funcional e metabólico de ambos os fenótipos já foram caracterizados. Estudos prévios de nosso grupo demostraram que a Crotoxina (CTX) exerce em macrófagos duas ações que os tornam aplicáveis em terapia celular: 1) altera seu perfil metabólico e funcional e 2) estes efeitos são de longa duração. Tais efeitos são observados após uma única e curta exposição à toxina. Neste contexto, esta pesquisa buscou caracterizar o metabolismo e o estado funcional de MØ tratados com diferentes concentrações de CTX, com o objetivo de verificar se em cada concentração é possível identificar fenótipos distintos e intermediários aos perfis M1 e M2 já descritos, para assim buscar reprogramar essas células de acordo com processos fisiopatológicos específicos. A capacidade de reprogramação fenotípica de monócitos induzida pela CTX foi avaliada em ensaios in vitro, utilizando células da linhagem monocítica humana (THP-1), incubadas previamente com meio RPMI (controle), ou LPS (1ug/mL) ou meio condicionado tumoral de MCF-7 (MCT) por 48 horas. Posteriormente, elas foram incubadas na ausência (controle) ou presença de CTX em diferentes concentrações (2 nM; 10 nM; 50 nM e 100 nM) ao longo de 1 hora. Após os diferentes protocolos de incubação com a toxina foram analisados os marcadores de diferenciação e de fenótipos, por meio da técnica de qPCR, sendo que os últimos também foram analisados por meio de citometria de fluxo. Para avaliar os efeitos dos tratamentos sobre as funções celulares, foram analisadas a capacidade de fagocitose, a geração de espécies reativas de oxigênio (H2O2) e a produção de citocinas pelos MØ. O metabolismo celular foi avaliado por meio da expressão gênica e atividade das enzimas chave da via glicolítica. Os dados apresentados evidenciam que células THP-1 são satisfatoriamente diferenciadas por LPS (1 µg/mL) e meio condicionado tumoral-MCT (Vol. obtido de 1x106 /mL) e essas células têm suas funções moduladas distintamente pela CTX, a depender da concentração utilizada. A CTX acarretou ação dual sobre as funções destes macrófagos humanos, uma vez que induziu inibição da atividade de fagocitose, ao mesmo tempo que estimulou a produção de H2O2 em células controle. Porém, esses efeitos mudam dependendo dos estímulos do microambiente, já que, em contexto tumoral e inflamatório a fagocitose foi preservada de modo concentração-dependente, acompanhada do aumento da liberação de H2O2 em algumas concentrações. Em relação às vias metabólicas, as células THP-1 não diferenciadas não apresentaram alteração na expressão gênica de nenhuma das enzimas glicolíticas avaliadas, sob o efeito de quaisquer concentrações da CTX, sugerindo que a toxina não modula a expressão dessas enzimas na célula THP-1 na condição de monócito. Porém, quando estimuladas por LPS e MCT a CTX modulou a expressão gênica de algumas enzimas: a concentração de 50 nM aumentou a expressão de enzimas de vias metabólicas que estão mais ativas em M1 (PFK, FAS e citrato sintase) e ainda reduziu a atividade da enzima CPT-1 (lipólise), cuja alta atividade está relacionada ao perfil M2. Estes efeitos foram acompanhados do aumento de citocinas pró-inflamatórias. No ambiente inflamatório (LPS) a concentração de 10 nM da toxina promoveu a marcação positiva concomitante de marcadores tanto de M1 quanto de M2. Já em 100 nM a CTX promoveu liberação paralela de citocinas pró- e anti-inflamatórias. Reunidos, os resultados nos permitem afirmar que a CTX modula funções e as vias bioenergéticas de macrófagos humanos, dependendo da concentração utilizada e do estímulo de microambiente envolvido.

Importancia de los macrófagos cargados con hemosiderina en el diagnóstico de la hemorragia alveolar difusa / Importance of hemosiderin-loaded macrophages in diagnosis of diffuse alveolar hemorrhage / A importância dos macrófagos carregados com hemosiderina no diagnóstico de hemorragia alveolar difusa / Reconocimiento a la trayectoria del Prof. Dr. Juan Miguel Castagnino†

Resumen La hemorragia alveolar difusa (HAD) es un síndrome clínico con una alta mortalidad que compromete la función respiratoria. Su diagnóstico se basa en pruebas clínicas, radiológicas y citológicas. El objetivo del trabajo fue ratificar el valor de referencia de hemosiderófagos en lavados broncoalveolares (BAL) (hemosiderófagos ≥20%), correlacionar con la etiología y definir las condiciones preanalíticas para que la reacción de Perls alcance valores elevados de sensibilidad. De 109 muestras de pacientes con sospecha de HAD, se analizaron 90 por cumplir los criterios de inclusión; 36 resultaron positivas para HAD, 3 falsamente negativas y 51 resultaron negativas. La sensibilidad fue de 92% y la especificidad de 100%. La mediana de hemosiderófagos para muestras con diagnóstico de HAD fue de 70%. Se agruparon según la etiología: procesos infecciosos puros (PI), enfermedades autoinmunes puras (EA), enfermedades neoplásicas puras (EN), enfermedades autoinmunes más procesos infecciosos (EA+PI), enfermedades neoplásicas más procesos infecciosos (EN+PI), misceláneas (MI). La mediana de hemosiderófagos para cada grupo fue: PI (n=7) 50%, EA (n=15) 58%, EN (n=6) 73%, EA+PI (n=5) 80%, EN+PI (n=4) 80%, MI (n=2) 45% (p=0,57). El porcentaje de pacientes fallecidos fue de 49% (n=19), con una mediana de hemosiderófagos de 70%, en comparación con la de pacientes no fallecidos de 64% (p=0,25). Se ratificó el valor de referencia para establecer el diagnóstico de HAD en muestras de BAL obtenidas luego de las 36 h de comenzados los síntomas utilizando la reacción de Perls, la cual demuestra una alta sensibilidad y especificidad para dicho diagnóstico.

Abstract Difusse alveolar hemorrhage (DAH) is a clinical syndrome with high mortality. Its diagnosis is based on clinical, radiological and cytological tests. The objective of this study was to ratify the reference value of hemosiderophages in bronchoalveolar lavages (BAL) (hemosiderophagues ≥20%), to correlate with the etiology and define the pre-analytical conditions for the Perls reaction to reach high sensitivity values. Out of the 109 samples from patients with suspected ADH, 90 were analysed for meeting the inclusion criteria; 36 were positive for HAD, 3 were false negatives, and 51 were negative (sensitivity 92%; specificity 100%). The median number of hemosiderophagues for samples with a diagnosis of ADH was 70%; they were grouped according to etiology: pure infectious processes (PI), pure autoimmune diseases (AD), pure neoplastic diseases (ND), autoimmune diseases plus infectious processes (AD + PI), and miscellaneous (MI). The median number of hemosiderophagues for each group was: PI (n=7) 50%, AD (n=15) 58%, ND (n=6) 73%, AD + PI (n=5) 80%, ND + PI (n=4) 80%, MI (n=2) 45% (p=0.57). The percentage of deceased patients was 49% (n=19), with a median hemosiderophague of 70%, compared with 64% of non-deceased patients (p=0.25). The reference value to establish the diagnosis of ADH in BAL simples obtained 36 hours after the beginning of symptoms using the Perls reaction was ratified, which shows a high sensitivity and specificity to make the diagnosis of ADH.

Resumo A hemorragia alveolar difusa (HAD) é uma síndrome clínica com alta mortalidade que compromete a função respiratória. Seu diagnóstico se baseia em testes clínicos, radiológicos e citológicos. O objetivo do trabalho foi ratificar o valor de referência de hemossiderófagos em lavagens broncoalveolares (LBA) (hemossiderófagos ≥20%), relacioná-los com a etiologia e definir as condições pré-analíticas para que a reação de Perls alcance valores elevados de sensibilidade. De 109 amostras de pacientes com suspeita de HAD, 90 foram analisadas para cumprir com os critérios de inclusão; 36 resultaram positivas para HAD, 3 foram falsos negativos e 51 resultaram negativas. A sensibilidade foi de 92% e a especificidade de 100%. A média de hemossiderófagos para amostras com diagnóstico de HAD foi de 70%, eles foram agrupados de acordo com a etiologia: processos infecciosos puros (PI), doenças autoimunes puras (DA), doenças neoplásicas puras (DN), doenças autoimunes mais processos infecciosos (DA+PI), doenças neoplásicas mais processos infecciosos (DN+PI), miscelâneas (MI). A média de hemossiderófagos para cada grupo foi: PI (n=7) 50%, DA (n=15) 58%, DN (n=6) 73%, DA+PI (n=5) 80%, DN+PI (n=4) 80%, MI (n = 2) 45% (p= 0,57). A porcentagem de pacientes falecidos foi de 49% (n=19), com uma média de hemossiderófagos de 70%, em comparação com 64% de pacientes não falecidos (p=0,25). Foi ratificado o valor de referência para estabelecer o diagnóstico de HAD em amostras LBA obtidas 36 horas após o início dos sintomas através da reação de Perls, que apresenta alta sensibilidade e especificidade para esse diagnóstico.

La sucralosa promueve la polarización a macrófagos proinflamatorios M1

RESUMEN La sucralosa es un edulcorante no calórico de amplio consumo a nivel mundial, es considerado como un aditivo seguro, debido a que es eliminado en periodos cortos de tiempo. Recientemente se evidenció su bioacumulación en tejido adiposo, donde se encuentran inmersos macrófagos, células del sistema inmune involucradas en el desarrollo de la inflamación sistémica de bajo grado. A la fecha, no se cuenta con suficiente información para demostrar si los edulcorantes potencian los procesos inflamatorios alterando la función de células presentes en tejido y/o contribuyen en el desarrollo de patologías metabólicas. Por lo anterior, en nuestro trabajo se evaluó el efecto de la sucralosa en la viabilidad de los macrófagos diferenciados de la línea celular monocítica THP-1, por azul de tripán y ensayos de MTT, así como su efecto en la polarización M1/M2 por PCR según la expresión de IRF4, IRF5, STAT1, STAT6, perfil de expresión de IL-6, IL-12, TNF-α, TGF-β, IL-10 y SOCS3 por qPCR, y la cuantificación de la quimiocina IP-10 por ELISA. Los resultados indicaron que la sucralosa no tiene efectos citotóxicos, pero disminuye el número de células viables metabólicamente activas determinadas por MTT de manera dependiente de la concentración. La sucralosa incrementa la concentración de la quimiocina IP-10 y la expresión génica del factor de transcripción IRF5 y disminuye la expresión de IRF4 y STAT6, favoreciendo la polarización hacia poblaciones M1. La bioacumulación de sucralosa en tejido adiposo, y su interacción con macrófagos, podría inducir su polarización a M1.

ABSTRACT Sucralose is a non-nutritive sweetener widely consumed worldwide; it is considered a safe additive because it is eliminated quickly. Recently its bioaccumulation in adipose tissue was evidenced, where macrophages, cells of the immune system involved in developing low-grade systemic inflammation, are found. To date, there is a paucity of information regarding whether sweeteners potentiate inflammatory processes by altering the function of cells present in tissue and/or contribute to the development of metabolic pathologies. We evaluate the effect of sucralose on the viability of differentiated macrophages of the monocytic cell line THP-1, by trypan blue and MTT assays, respectively, as well as its effect on M1/ M2 by PCR according to the expression of IRF4, IRF5, STAT1, STAT6, expression profile of IL6, IL-12, TNF-α, TGF-β, IL-10 and SOCS3 by qPCR, and the quantification of the chemokine IP-10 by ELISE. The results indicated that sucralose has no cytotoxic effects but decreases the number of metabolically active viable cells determined by MTT of macrophages in a concentration-dependent manner. Sucralose increased the concentration of the chemokine IP-10 and the gene expression of the transcription factors IRF5 and decreased the expression of IRF4 and STAT 6 gene expression, favoring polarization towards M1 populations. The bioaccumulation of sucralose in adipose tissue, and its interaction with macrophages, could induce its polarization to M1.

The influence of macrophage polarisation status and IL-6 in breast carcinoma invasion / La influencia del estado de polarización de los macrófagos y la IL-6 en la invasión del carcinoma de mama

Introduction: Breast cancer metastasis accounts for the majority of deaths from breast cancer. The knowledge on IL-6 affecting cancer cell metatastatic behaviour need to be studied.Objectives: This study aim to examine the association of macrophage polarisation status and IL-6 with clinicopathological criteria and lymphovascular invasion (LVI) of breast carcinoma.Material & Method: 81 cases of FFPE breast carcinoma samples were stained with IL6, CD80 (M1 macrophage), CD204 and CD163 (M2 macrophage) and CD68 (pan-macrophage marker). The macrophages count were evaluated based on 3 hotspots of positively stained cells. IL-6 scoring was done using the H-score method.Result: Significant association was observed between CD68 marker with blood vessel invasion (p-value = 0.014), lymphatic vessel invasion (p-value = 0.005), and metastasis (p-value =0.028). CD68 was also significantly associated with CD204 (p = 0.027). CD80 biomarker also showing significant association with patient tumour grade (p-value = 0.054), ER (0.028) and PR (0.010) in patient clinical data and CD204 is significantly associated with ER (0.053) and PR (0.054) patient clinical data. Meanhile, there is no significant association of IL-6 with the patient clinical data.Conclusion: There is no significant association of IL-6 with the patient clinicopathological data obtained in this study while CD68 showed significant correlation with M2 macrophage biomarker and LVI indicating the influence of M1 and M2 macrophage in breast cancer metastatic pathway through blood and lymphatic vessel invasion. (AU)

Introducción: La metástasis del cáncer de mama representa la mayoría de las muertes por cáncer de mama. Es necesario estudiar el conocimiento sobre la IL-6 que afecta el comportamiento metatastásico de las células cancerosas.Objetivos: Este estudio tiene como objetivo examinar la asociación del estado de polarización de los macrófagos y la IL-6 con los criterios clínico-patológicos y la invasión linfovascular (LVI) del carcinoma de mama.Material y método: 81 casos de muestras de carcinoma de mama FFPE se tiñeron con IL6, CD80 (macrófago M1), CD204 y CD163 (macrófago M2) y CD68 (marcador pan-macrófago). El recuento de macrófagos se evaluó en base a 3 hotspots de células teñidas positivamente. La puntuación de IL-6 se realizó mediante el método de puntuación H.Resultado: Se observó una asociación significativa entre el marcador CD68 con invasión de vasos sanguíneos (valour de p = 0,014), invasión de vasos linfáticos (valour de p = 0,005) y metástasis (valour de p = 0,028). CD68 también se asoció significativamente con CD204 (p = 0.027). El biomarcador CD80 también muestra una asociación significativa con el grado del tumour del paciente (valour p = 0,054), ER (0,028) y PR (0,010) en los datos clínicos del paciente y el CD204 se asocia significativamente con los datos clínicos del paciente ER (0,053) y PR (0,054). Mientras tanto, no existe una asociación significativa de IL-6 con los datos clínicos del paciente.Conclusión: No existe una asociación significativa de IL-6 con los datos clínico-patológicos del paciente obtenidos en este estudio, mientras que CD68 mostró una correlación significativa con el biomarcador de macrófagos M2 y LVI que indica la influencia de los macrófagos M1 y M2 en la vía metastásica del cáncer de mama a través de la invasión de vasos sanguíneos y linfáticos. (AU)

Identificación de macrófagos y virus Epstein-Barr en biopsias de pacientes con Síndrome de Sjögren

RESUMEN El síndrome de Sjögren (SS) es una enfermedad crónica mediada inmunológicamente. La presencia de macrófagos y el virus Epstein-Barr (VEB) se ha relacionado con su desarrollo y severidad. Los macrófagos contribuyen al proceso autoinmune local y la infección viral promueve el quiebre de la auto-tolerancia. Objetivos. Identificar la presencia de Macrófagos en el infiltrado inflamatorio y VEB en células inflamatorias, correlacionándolos con las características histológicas de glándulas salivales labiales. Metodología. En biopsias de glándulas salivales labiales (8 pacientes y 7 individuos controles) se realizó inmunohistoquímica antiCD-68 para identificar macrófagos. El conteo de macrófagos y células inflamatorias se efectuó en relación a su distribución en las glándulas salivales. La presencia del virus fue evaluada mediante hibridación in situ e inmunohistoquímica para LMP1. Se utilizó el test t no pareado y de Mann-Whitney para comparar los grupos, y coeficiente de correlación de Pearson para correlacionar con parámetros histológicos. Resultados. Se observó un mayor número de macrófagos en el infiltrado inflamatorio de pacientes (p=0,001**). Los macrófagos se distribuyeron difusamente en las glándulas de controles y en los focos inflamatorios de pacientes. En ambos grupos no se detectó la presencia del virus Epstein-Barr. Conclusión. Los pacientes con síndrome de Sjögren presentaron mayor presencia de macrófagos y su incremento es a expensas del foco inflamatorio.

ABSTRACT: Sjögren's syndrome (SS) is an immunologically mediated chronic disease of complex etiopathogenesis. Macrophages and Epstein-Barr virus are among the factors related to its development and severity. Macrophages contribute to the local autoimmune process and viral infection promotes the breakdown of self-tolerance. Objectives. Identify the presence of macrophages in the inflammatory infiltrate and Epstein-Barr virus in inflammatory cells, correlating them with the histological features of labial salivary glands. Methodology. In labial salivary glands biopsies of 8 patients and 7 control individuals, anti-CD-68 immunohistochemistry was performed to identify macrophages. The macrophages and inflammatory cells were counted in relation to their distribution in the salivary glands. The presence of the virus was evaluated by in situ hybridization for viral RNA and immunohistochemistry for latent membrane protein type 1. The comparison between both groups was made using the unpaired t-test and Mann-Whitney test. The correlations with histological parameters were established with the Pearson´s correlation coefficient. Results. A greater number of macrophages was observed in the inflammatory infiltrate of SS patients (p=0,001**). Macrophages in control individuals were diffusely distributed in the gland, while, SS in patients, they were mainly located in inflammatory foci. In both groups, no inflammatory or epithelial cells infected by the Epstein-Barr virus were identified. Conclusion. Patients with Sjögren's syndrome had a greater presence of macrophages and their increase is at the expense of the inflammatory focus.

Are statins a risk factor in patients with atherosclerosis? / ¿Son las estatinas un factor de riesgo en pacientes con aterosclerosis?

SUMMARY: Statins inhibit cholesterol synthesis, but also have other pleiotropic effects. There are indications that they affect macrophage survival trough the regulation of apoptosis. We analyzed 50 samples of aortic wall, selected based on statins in patients' therapy (n=25, Th-S group) or statin-free therapy (n=25, Th-nonS group). Each group had 5 samples of healthy aortic tissue, 10 samples of mild and 10 samples of severe atherosclerotic changes in aortic wall. Tissue was stained with hematoxylin-eosin and immunohistochemical methods (anti-Bcl-2 antibody). Presence of Bcl2-positive macrophages (Bcl-2+ MP) was determined semiquantitatively, and data were processed in Microsoft Excell and IMB SPSS 23 Statistics. 60 % of patients in the Th-S group had a mild increase of Bcl-2+ MP The use of statins leads to a significantly more frequent increase in Bcl2+ macrophages in the intima of the healthy aortic tissue. Analysis of all aortic samples with pathohistological diagnosis showed that statin therapy was statistically significantly more often leading to a markedly increased presence of Bcl-2+ MP. In the media, all samples of the Th-S group have a mild increase of Bcl-2+ MP, and in adventitia 40 % of patients. The use of statins more often leads to a markedly increased presence of Bcl-2+ MP in aortic tissue with diagnosed mild and severe atherosclerosis. In samples of severe atherosclerosis, statins lead to a markedly increased presence of Bcl-2+ MP in the parts of the plaque towards the intima and towards the media. Statins lead to an increased presence of Bcl-2+ macrophages, prolong their life, both in healthy and atherosclerotic altered aortic tissue. This indicates potentiation of inflammation and damage to the aortic wall, and calls into question the positive effect of statins on the aortic wall with atherosclerosis.

RESUMEN: Las estatinas inhiben la síntesis de colesterol, pero también tienen otros efectos pleiotrópicos. Hay indicios de que afectan la supervivencia de los macrófagos a través de la regulación de la apoptosis.Se analizaron 50 muestras de pared aórtica, seleccionadas en base a estatinas en tratamiento de pacientes (n=25, grupo Th-S) o en tratamiento libre de estatinas (n=25, grupo Th- nonS). Cada grupo tenía 5 muestras de tejido aórtico sano, 10 muestras de cambios ateroscleróticos leves y 10 muestras de cambios ateroscleróticos severos en la pared aórtica. El tejido se tiñó con hematoxilina-eosina y métodos inmunohistoquímicos (anticuerpo anti-Bcl-2). La presencia de macrófagos positivos para Bcl2 (Bcl- 2+ MP) se determinó semicuantitativamente y los datos se procesaron en Microsoft Excell e IMB SPSS 23 Statistics. El 60 % de los pacientes del grupo Th-S tuvo un aumento leve de Bcl-2+ MP. El uso de estatinas conduce a un aumento significativamente más frecuente de macrófagos Bcl2+ en la íntima del tejido aórtico sano. El análisis de todas las muestras aórticas con diagnóstico anatomopatológico mostró que la terapia con estatinas fue significativamente más frecuente desde el punto de vista estadístico, lo que condujo a una presencia marcadamente mayor de Bcl-2+ MP. En los medios, todas las muestras del grupo Th-S tienen un leve aumento de Bcl-2+ MP, y en adventicia en el 40 % de los pacientes. El uso de estatinas con mayor frecuencia conduce a una presencia marcadamente mayor de MP Bcl-2+ en el tejido aórtico con aterosclerosis leve y grave diagnosticada. En muestras de aterosclerosis severa, las estatinas conducen a una presencia aumentada de Bcl-2+ MP en las partes de la placa hacia la íntima y hacia la media. Las estatinas conducen a una mayor presencia de macrófagos Bcl-2+, prolongan su vida, tanto en tejido aórtico sano como aterosclerótico alterado. Esto indica la potenciación de la inflamación y el daño a la pared aórtica y pone en duda el efecto positivo de las estatinas en la pared aórtica con aterosclerosis.

Efeito da fumaça do cigarro na periodontite apical induzida em ratos: análise do perfil inflamatório e imuno-histoquímica macrofágica / Effect of cigarette smoke inhalation on induced apical periodontitis in rats: inflammatory profile and macrophage immunohistochemistry analysis

Objetivo: Avaliar a severidade da periodontite apical (PA) em ratos expostos à fumaça do cigarro, por meio da análise histológica do perfil inflamatório e imunomarcação macrofágica. Material e Métodos: Foram utilizados trinta e dois ratos machos Wistar distribuídos em quatro grupos (n=8): PA (ratos com PA induzida); F (ratos expostos à fumaça do cigarro); FPA (ratos com PA induzida expostos à fumaça do cigarro); C (ratos sem PA e sem exposição ao cigarro). Para inalação da fumaça do cigarro, os animais permaneceram em câmara de tabagismo por oito minutos, três vezes ao dia por vinte dias antes da indução da PA. Em seguida, os animais tiveram as polpas coronárias expostas ao meio oral por 30 dias para a indução da PA e continuaram inalando fumaça até completarem 50 dias. No momento da eutanásia, as hemi-maxilas do lado direito foram removidas para avaliar o perfil inflamatório por coloração em hematoxilina e eosina e imuno-histoquímica para marcação macrofágica F4/80 (macrófago), CD206 (M2) e iNOS (M1). Dados não paramétricos foram analisados por Kruskal-Wallis, seguido de post-hoc Dunn e Mann- Whitney (P<.05). Resultados: O infiltrado inflamatório foi moderado no grupo PA e intenso no grupo FPA (P>.05). Na imunomarcação de macrófagos M1, os grupos C e F apresentaram diferenças significantes quando comparado aos grupos PA e FPA (P<0,05). No anticorpo F4/80 não houve diferença entre os grupos (P>.05). Conclusão: A inalação da fumaça do cigarro em ratos contribuiu para uma reação inflamatória periapical mais intensa, com presença predominante de macrófagos pró-inflamatórios M1, agravando a severidade da periodontite apical(AU)

Objective: To evaluate the severity of apical periodontitis (AP) in rats exposed to cigarette smoke, through histological analysis of the inflammatory profile and macrophage immunostaining. Material and Methods: thirty-two male Wistar rats were used, distributed into four groups (n=8): PA (rats with induced AP); F (rats exposed to cigarette smoke); FPA (AP-induced rats exposed to cigarette smoke); C (rats without AP and without exposure to cigarettes). For cigarette smoke inhalation, animals remained in a smoking chamber for eight minutes, three times daily for twenty days before AP induction. Then, animals had the coronary pulp exposed to oral environment for 30 days to induce AP while continued inhaling smoke until completing 50 days of experimental period. During euthanasia process, the right hemimaxillas were removed to assess inflammatory profile by hematoxylin and eosin staining and immunohistochemistry for macrophage immulabeling: F4/80 (macrophage), CD206 (M2) and iNOS (M1). Nonparametric data were analyzed by Kruskal-Wallis, followed by post-hoc Dunn and Mann-Whitney (P<.05). Results: The inflammatory infiltrate was moderate in the PA group and intense in the FPA group (P<.05). Histomorphometric analysis of M2 macrophages revealed statistical differences between groups C and PA, and F and FPA (P>.05). In the immunostaining of M1 macrophages, groups C and F showed significant differences when compared to groups PA and FPA (P<0.05). While the PA and FPA groups presented a large amount of immunoreactive cells, being higher for the FPA group (P<0.05). In the F4/80 antibody there was no difference between the groups (P>.05)Conclusion: Inhalation of cigarette smoke in rats contributed to a more intense periapical inflammatory reaction, with a predominant presence of pro-inflammatory M1 macrophages, aggravating the severity of apical periodontitis(AU)

A influência de macrófagos M1, M2 e TAM, e do receptor P2X7 na invasividade e resistência de neuroblastoma / The influence of different macrophages' phenotypes, and of the P2X7 receptor, on the invasiveness and chemoresistance of neuroblastoma

O neuroblastoma é um tumor sólido muito comum em crianças. O estágio mais avançado da doença é altamente agressivo e invasivo, além de pouco responsivo à terapia, que é limitada por mecanismos de resistência e reincidência relacionados à metástase. Muitos estudos tem sido feitos para identificar mecanismos de invasão e quimioresistência de células tumorais, afim de aumentar a sobrevida dos pacientes com câncer. Nesse trabalho, nós estudamos o efeito dos macrófagos, as células imunes mais abundantes no microambiente tumoral, os TAMs (do inglês tumor-associated macrophage) e do receptor P2X7, um purinoreceptor acionado por ATP, nesses processos. Os TAMs respondem e atuam de acordo com a miríade de fatores que encontram, podendo gerar populações heterogêneas e com funções distintas, tanto antitumorais, como pró-tumorais. Altos níveis de ATP extracelular são encontrados no microambiente tumoral, podendo então ativar o receptor P2X7. Este receptor tem sido relacionado tanto a funções inflamatórias como funções na resolução da inflamação de macrófagos. Além disso, o receptor P2X7 está envolvido em uma variedade de eventos celulares, incluindo a secreção de mediadores pró-inflamatórios, a proliferação celular e a apoptose de células tumorais. Primeiramente, foi avaliado o papel do receptor P2X7 na polarização de macrófagos da derivados medula óssea de camundongos wild-type e nocaute para o P2X7 na presença e ausência de fatores secretados por células de neuroblastoma, e então foi estudada a influência desses diferentes macrófagos polarizados em eventos celulares de grande relevância clínica para o neuroblastoma: a invasividade e quimiorresistência. Os resultados demonstraram que, apesar do reconhecido envolvimento do receptor P2X7 na inflamação, a ausência deste receptor não atenua a expressão de marcadores característicos do fenótipo inflamatório, M1. O aumento da expressão do receptor P2Y2, também envolvido na inflamação, nessas células, sugere um mecanismo genético de compensação para não atenuação da inflamação em macrófagos que não expressam o receptor P2X7. Contudo, a ausência do receptor P2X7 levou a alterações no fenótipo alternativo, M2, de modo que a expressão de Tnf, marcador de M2, não foi reprimido. TAMs noucates para P2X7 tiveram a expressão de arg1, marcador de M2, suprimida, reforçando a importância do receptor P2X7 no estabelecimento de fenótipos ativados alternativamente. Nossos dados também sugerem que ausência do receptor P2X7 em TAMs permite a aquisição de um fenótipo capaz de tornar as células de neuroblastoma que expressam P2X7 mais invasivas e mais quimioresistentes à vincristina. Por outro lado, TAMs, independentemente da presença ou ausência do receptor P2X7, induziram a proliferação e quimioresistência das células de neuroblastoma silenciadas para o receptor P2X7, o que nos leva a concluir que o receptor P2X7 em TAMs é desfavorável à progressão de tumores expressando P2X7

Neuroblastoma is a highly common childhood solid tumor. The most advanced stage of the disease is highly aggressive and invasive, besides from being poorly responsive to therapies, which are limited by resistance and recurrence mechanisms related to metastasis. Several studies attempt to identify invasion and resistance mechanisms of the tumor cells in order to increase overall survival of the patients. On the present work, we investigated the effect of macrophages, the most abundant immune cells on the tumor microenvironment, called TAMs (tumor-associated macrophages), and of the P2X7 receptor, an ATP-gated purinoceptor, on these processes. TAMs and cancer cells crosstalk, and behave accordingly to a miriad of factors present at the TME, generating heterogeneous populations with distinct functionalities, either pro- or antitumor. High extracellular levels of ATP are found in the TME, being able to activate the P2X7 receptor. This receptor mediates both pro- and anti-inflammatory functions in macrophages. In addition, it is involved in several cellular events, including the secretion of pro-inflammatory mediators, cell proliferation and tumor cell apoptosis. At first, we evaluated the role of the P2X7 receptor on the polarization of bone marrow-derived macrophages (BMDM), either wild-type or knockout for the P2X7 receptor, in presence or absence or factors secreted by neuroblastoma cells. Next, we investigated the influence of the polarized macrophages in highly relevant cellular events for neuroblastoma, such as invasiveness and chemoresistance. Our results showed that, despite the known involvement of P2X7 receptor on inflammation, its absence did not decrease the expression if inflammatory markers of M1 macrophage populations. An increase in the expression of the P2Y2 receptor, also involved in inflammation, on these cells suggest a genetic compensation mechanism for preventing attenuation of inflammation when P2X7 is lacking. However, P2X7 receptor absence did compromise the M2 phenotype, driving the expression of Tnf. TAMs knockout for the P2X7 receptor were not able to express arg1, also an M2 marker, reinforcing a role of the P2X7 receptor on establishing alternative macrophage phenotypes. Our data also suggest that TAMs lacking the P2X7 receptor acquire a phenotype capable of turning P2X7R-expressing neuroblastoma cells more invasive and chemoresistant to vincristine. On the other hand, TAMs, independently on the presence of the P2X7 receptor, induced proliferation and resistance of neuroblastoma cells silenced for P2X7 receptor expression, leading us to the conclusion that the P2X7 receptor in TAMs is unfavorable for the progression of P2X7R-expressing tumors

Análise dos mecanismos pró-inflamatórios do ácido úrico solúvel: efeito sobre proteínas sensíveis à modulação redox e sobre a polarização de células THP-1 / Analysis of the pro-inflammatory mechanisms of soluble uric acid: effect on redox sensitive proteins and THP-1 cell polarization

Vários estudos epidemiológicos estabelecem correlação positiva entre os níveis de ácido úrico sérico e o aumento do risco para doenças cardiovasculares. Fatores dietéticos e socioeconômicos, além da presença de comorbidades estão diretamente associados aos níveis séricos de ácido úrico. Países desenvolvidos apresentam maior incidência e prevalência da gota e alguns grupos étnicos são particularmente susceptíveis à hiperuricemia. Cristais de ácido úrico são descritos por iniciar e perpetuar resposta inflamatória, e sinalizar um padrão de resposta molecular associado ao dano (DAMP), permitindo a diferenciação de macrófagos para perfis pró-inflamatórios. Por outro lado, os efeitos do ácido úrico em sua forma solúvel ainda carecem de estudos. Macrófagos derivados de precursores monocíticos apresentam diferenciação específica e respondem a um conjunto de fatores extrínsecos, resultando em perfis distintos, um fenômeno conhecido como polarização. Assim, os macrófagos podem ser classicamente ativados para uma resposta Th1 (T helper 1) e polarizados a um perfil pró- inflamatório (M1, resposta Th1) ou a um perfil alternativo e oposto, um perfil de resolução da inflamação (M2, resposta Th2, T helper 2). Nesse sentindo, buscamos analisar os efeitos do ácido úrico solúvel sobre vias de modulação da polarização fenotípica de macrófagos e modificação redox. Utilizamos a linhagem monocítica humana THP-1, a qual foi diferenciada em macrófagossímile por acetato miristato de forbol (PMA; 5 ng.mL-1) por 48 h, seguidas da incubação com ácido úrico em meio ausente de tióis e soro fetal bovino por 8h ou 24h (0-1000 µM). A expressão de fatores de transcrição e marcadores de polarização foi realizada através de citometria de fluxo, western-blotting e por microscopia de fluorescência com alto conteúdo de imagens (HCI). Em concentrações fisiológicas, verificamos que o ácido úrico solúvel regulou positivamente a frequência de células para receptor manose CD206, um marcador clássico de perfil alternativo/M2 e regulou negativamente a expressão óxido nítrico sintase induzível (iNOS), um marcador M1, sugerindo inicialmente uma modulação para o perfil de polarização M2. Além disso, as proteínas redoxsensíveis, heme oxigenase-1 (HO-1) e tiorredoxina (Trx) tiveram sua expressão reduzida e aumentada, respectivamente, pelo tratamento com ácido úrico. Os fatores de transcrição Nrf2 e STAT3 tiveram regulação negativa após a exposição ao ácido úrico solúvel. Os resultados apresentados nesta tese sugerem uma função do urato no priming de macrófagos através da alteração da polarização destas células

Several epidemiological studies have established a positive correlation between high serum uric acid levels and increased risk for cardiovascular diseases. Developed countries have a higher incidence and prevalence of gout and some ethnic groups are particularly susceptible to hyperuricemia. Although hyperuricemia is a prevalent condition, it has still controversy biological consequences. Uric acid crystals are described as capable of initiating and perpetuating inflammatory responses, by activating the damage-associated molecular response pattern (DAMP) cascade, allowing macrophage differentiation to inflammatory profiles. In spite of that, biological response to soluble uric acid are not completely understood. Monocyte-derived macrophages respond to a set of extrinsic factors that result in different profiles and can be polarized to a proinflammatory (M1) or anti-inflammatory (M2) profile. In this thesis, we analyzed the effects of soluble uric acid on redox-modulated pathways and the phenotypic polarization of macrophages. We used human monocytic THP-1 cell line, differentiated into macrophage by phorbol myristate acetate (PMA; 5 ng.mL-1) for 48 h. After differentiation, cells were incubated with soluble uric acid in medium without thiols and fetal bovine serum for 8 h and 24 h (0-1000 µM). The expression of transcription factors and polarization markers were assessed by flow cytometry, western-blotting and fluorescence microscopy with high content imaging (HCI). At physiological concentrations, soluble uric acid positively regulated the frequency of cells for mannose receptor CD206, a classic marker of the anti-inflammatory M2 profile and negatively regulated the inducible nitric oxide synthase (iNOS) expression, a proinflammatory M1 marker, suggesting that the soluble uric acid changes the polarization profile to M2 profile. In addition, the redox-sensitive proteins heme oxygenase-1 (HO-1) and thioredoxin (Trx) had their expression decreased and increased, respectively, after exposure to urate. STAT3 and Nrf2 transcription factors were downregulated upon soluble uric acid exposure. The results presented in this thesis suggest a role of uric acid in macrophage priming through the alteration of cell polarization

Análise imunológica dos efeitos dos cimentos MTA, Bio-C Repair e Bio-C Repair Íon+ nas respostas de macrófagos inflamatórios de murino / Effects of cements MTA, Bio-C Repair and Bio-C Repair Ion+ on inflammatory murine macrophage responses, an immunological analysis

As melhorias alcançadas nas propriedades físico-químicas dos materiais endodônticos permitiram a utilização de materiais de reparo em situações clínicas que eram consideradas críticas. Os chamados biocerâmicos, derivados do MTA, apresentando boa biocompatibilidade e bioatividade, se tornaram uma solução eficaz. Estes materiais apresentam propriedades clínicas melhoradas, com excelente consistência e manuseabilidade, além de adequado tempo de trabalho e presa. Estes cimentos seguem em evolução e as empresas vêm investindo em melhorias em suas composições com o intuito de potencializar suas propriedades biotivas. Este trabalho teve como objetivo avaliar o cimento biocerâmico Bio-C Repair (Angelus, Londrina, Paraná, Brasil) e o seu potencial sucessor, o cimento Bio-C Repair Íon+ (Angelus, Londrina, Paraná, Brasil), bem como o MTA (Angelus, Londrina, Paraná, Brasil). Foi aprovado pelo Comitê de Ética no Uso de Animal (CEUA-UFMG 350/2019). Tais biocerâmicos foram avaliados quanto às respostas de macrófagos. Os experimentos foram realizados no laboratório de Gnotobiologia e Imunologia do Instituto de Ciências Biológicas (ICB) da Universidade Federal de Minas Gerais. Utilizou-se macrófagos murinos obtidos de camundongos C57BL/6 quando se avaliou a viabilidade celular (pelo método MTT), a aderência celular, a capacidade de fagocitose (na presença da levedura S. boulardii) e a detecção da produção de Espécies Reativas de Oxigênio (ROS), na ausência e na presença de Zymosan A (de Saccharomyces cerevisiae), bem como, na presença e na ausência dos cimentos. Os macrófagos inflamatórios foram obtidos do peritônio dos animais após a injeção de caldo Tioglicolato estéril a 3%. Após aspirados, os macrófagos foram centrifugados e a concentração celular final foi ajustada de acordo com cada ensaio proposto: viabilidade e aderência (1x106 cel/mL); ensaio de fagocitose e ROS (5x105 cel/mL). Fez-se a manipulação dos materiais sob fluxo laminar, quando foram inseridos em capilares estéreis. Os resultados de viabilidade celular demonstraram que houve diferença significativa na cultura de 24 horas, tratada com o Bio-C Repair Íon+, em relação ao grupo controle. Os ensaios de fagocitose e aderência celular não apresentaram diferença estatisticamente significante entre os grupos. As análises demonstraram expressivos níveis de ROS quando as células foram tratadas na presença de Zymozan A. Na presença desse estímulo, o Bio-C Repair Íon+ apresentou diferença significativa em relação a todos os demais biocerâmicos e ao grupo controle. Os resultados foram analisados pelo teste ANOVA (P<0,05), comparando-se os grupos experimentais entre si e o grupo controle. Conclui-se que o novo material reparador Bio-C Repair Íon+ apresenta ações de biocompatibilidade quase semelhantes ao Bio-C Repair e MTA. As diferenças observadas em relação ao Bio-C Repair Ion+ quanto à viabilidade celular e a produção de ROS podem estar relacionadas ao íon metálico presente em sua composição.

The improvements achieved in the physicochemical properties of endodontic materials allowed the use of repair materials in clinical situations considered critical. The so-called bioceramics, derived from MTA, showing good biocompatibility and bioactivity, have become an effective solution. These materials have improved clinical properties, exhibiting excellent consistency and handling, as well as good working and setting time. These types of cement are still evolving, and companies have been investing in improvements in their compositions to enhance their bioactive properties. This study aimed to evaluate the Bio-C Repair bioceramic cement (Angelus, Londrina, Paraná, Brazil) and its potential successor, the Bio-C Repair Íon+ (Angelus, Londrina, Paraná, Brazil), as well as the MTA (Angelus, Londrina, Paraná, Brazil). The Animal Use Ethics Committee (CEUA) of the Federal University of Minas Gerais (UFMG) approved the study (350/2019). Such bioceramics were evaluated in macrophage responses. The experiments were carried out in the Gnotobiology and Immunology laboratory of the Institute of Biological Sciences (ICB) of the UFMG. Murine macrophages obtained from C57BL/6 mice were used to evaluate cell viability (by the MTT method), cell adhesion, phagocytosis capacity (in the presence of the yeast S. boulardii), and in the detection of the production of Reactive Oxygen Species (ROS) in the absence and presence of Zymosan A (from Saccharomyces cerevisiae), as well as in the presence and absence of types of cement. Inflammatory macrophages were obtained by injecting sterile 3% thioglycolate broth into the animals' peritoneum. After aspirating, the macrophages were centrifuged, and the final cell concentration was adjusted according to each proposed assay: viability and adherence (1x106 cells/mL), phagocytosis, and ROS assay (5x105 cells/mL). The materials were manipulated under laminar flow when inserted into sterile capillaries. The cell viability results showed a significant difference in the 24-hour culture, treated with Bio-C Repair Ion+, to the control group. The phagocytosis and cell adhesion assays showed no statistically significant difference between the groups. The analyses showed expressive ROS levels when the cells were treated in the presence of Zymosan A. In the presence of this stimulus, the Bio-C Repair Ion+ showed a significant difference between all other bioceramics and the control group. The results were analyzed by the ANOVA test (P<0.05), comparing the experimental groups and the control group. It is concluded that the new repair material Bio-C Repair Ion+ has biocompatibility actions almost similar to Bio-C Repair and MTA. The differences observed with Bio-C Repair Ion+ regarding cell viability and ROS production may be related to the metallic ion's composition.

Evaluation of the immunomodulatory activity of thalidomide on tumor-associated macrophages in the 4T1 murine metastatic breast cancer model / [Avaliação do efeito imunomodulador da talidomida em macrófagos associados a tumores no modelo murino de câncer de mama metastático 4T1]

The present work evaluated the immunomodulatory effect of thalidomide (Thal) at different doses on tumor-associated macrophages (TAMs) using a mouse model of human breast cancer. Mice were inoculated with 4T1 cells in the left flank and treated with Thal once a day at concentrations of 50, 100, and 150mg/kg body weight from the 5th day until the 28th day of tumor inoculation. The tumors were sized, proliferation index and TAMs count were evaluated in primary tumors and metastatic lungs. In addition, the metastasis rate was evaluated in the lungs. Thal at 150mg/kg significantly decreased tumor growth, proliferation index, and TAMs infiltration in primary tumors. Conversely, a higher number of TAMs and lower proliferation index were observed in metastatic lungs in mice treated with 150mg/kg of Thal. Furthermore, Thal at 150mg/kg significantly decreased the metastatic nodules in the lungs. Our findings demonstrated that Thal treatment considerably decreased the primary tumor and lung metastasis in mice associated with different TAM infiltration effects in these sites.(AU)

No presente trabalho, foi avaliado o efeito imunomodulador de diferentes doses de talidomida em macrófagos associados ao tumor (TAMs), em um modelo murino de câncer de mama. Camundongos foram inoculados com células 4T1, na região do flanco esquerdo, e tratados com talidomida, uma vez ao dia, nas doses de 50, 100 e 150mg/k, por massa corporal, do quinto dia ao 28º dia de inoculação tumoral. Os tumores foram medidos, o índice de proliferação celular e a contagem de TAMs foram avaliados nos tumores primários e nos pulmões com metástases. Além disso, a taxa de metástases pulmonares também foi avaliada. A talidomida na dose de 150mg/kg diminuiu significativamente o crescimento tumoral, o índice de proliferação celular e a infiltração de TAMs nos tumores primários. Por outro lado, maior número de TAMs e menor índice de proliferação celular foram observados nos pulmões metastáticos, em camundongos tratados com 150mg/kg de talidomida. Ademais, a talidomida na dose de 150mg/kg diminuiu significativamente os nódulos metastáticos nos pulmões. Os resultados demonstraram que o tratamento com talidomida diminuiu o crescimento tumoral e as metástases pulmonares em camundongos, associado com diferentes efeitos na infiltração de TAMs nesses locais.(AU)

Efecto antiinflamatorio y antioxidante in vitro de Curcuma longa sobre macrófagos murinos durante la infección por Helicobacter pylori

RESUMEN Introducción: La colonización por Helicobacter pylori produce una inflamación en la mucosa gástrica con el consecuente desarrollo de enfermedades gastroduodenales. Frente a altas tasas de resistencia antimicrobiana y la ausencia de una vacuna en humanos, la alternativa ha sido la búsqueda de extractos de plantas con propiedades antimicrobiana, antiinflamatoria, antioxidante, antifúngica y anticancerígena como la Curcuma longa. Sin embargo, al ser una especie introducida y adaptada a las condiciones climáticas del país, son necesarios los estudios preclínicos que avalen su potencial antiinflamatorio y antioxidante. Objetivo: Evaluar el efecto del extracto de C. longa sobre macrófagos peritoneales infectados con H. pylori. Métodos: Para evaluar el efecto antiinflamatorio y antioxidante del extracto de C. longa sobre macrófagos murinos infectados por H. pylori, se evaluaron diferentes concentraciones del extracto y relaciones de bacteria, y se evaluó la muerte celular mediante DAPI. Se determinó la producción de óxido nítrico, peróxido de hidrógeno y los niveles de la interleucina-1β. Resultados: La viabilidad del macrófago se afectó frente a concentraciones de 100 µg/mL del extracto de cúrcuma y a partir de 25 bacterias/macrófago. Al combinar las diferentes concentraciones del extracto con las multiplicidades bacterianas se observó una reducción en los niveles de H2O2 e IL-1β; sin embargo, la reducción del óxido nítrico se observó en el rango de 6,25-50 µg/mL del producto natural. Conclusiones: El extracto de cúrcuma cubano mostró potencial antioxidante y antiinflamatorio al disminuir la citotoxicidad celular y la producción de especies reactivas del oxígeno en macrófagos peritoneales.

ABSTRACT Introduction: Colonization by Helicobacter pylori causes inflammation of the gastric mucosa with the consequent development of gastroduodenal diseases. In view of the high antimicrobial resistance rates and the absence of a vaccine for humans, the alternative has been to search for plant extracts with antimicrobial, anti-inflammatory, antioxidant, antifungal and anticancer properties. An example is Curcuma longa. However, being as it is a species introduced and adapted to the country's climate conditions, it is necessary to conduct preclinical studies demonstrating its anti-inflammatory and antioxidant potential. Objective: Evaluate the effect of a C. longa extract on peritoneal macrophages infected by H. pylori. Methods: With the purpose of describing the anti-inflammatory and antioxidant effect of C. longa on murine macrophages infected by H. pylori, an evaluation was conducted of various extract concentrations and bacterial relationships, while cell death was assessed by DAPI. Determination was made of nitric oxide and hydrogen peroxide production, as well as of interleukin-1β levels. Results: Viability of the macrophage was affected in the presence of 100 µg/ml concentrations of the turmeric extract and as from 25 bacteria / macrophage. When different concentrations of the extract were combined with the bacterial multiplicities, a reduction was observed in H2O2 and IL-1β levels. However, nitric oxide reduction was observed within the range of 6.25-50 µg/ml of the natural product. Conclusions: The Cuban turmeric extract was found to have antioxidant and anti-inflammatory potential by reducing cell cytotoxicity and the production of reactive oxygen species in peritoneal macrophages.

A novel activity on thymocytes cells exerted by the rattlesnake (Crotalus durissus cumanensis) venom / Nueva actividad de los timocitos estimulada por el veneno de la serpiente de cascabel (Crotalus durissus cumanensis)

Abstract. Introduction: The thymus is active mainly during the neonatal and pre-adolescent periods. Objective: To test naïve thymocytes proliferation and monocytes stimulation. Materials and methods: We collected fresh thymus tissue from neonate mice after surgery. Suspension cells were coated onto Ficoll-Hypaque support. The obtained cells (thymocytes) were cultured measuring the proliferation of naïve T cells stimulated by Crotalus durissus cumanensis (Cdc) venom at sub-lethal doses (20 ng). Then, we supplemented the wells with AlamarBlue™ and incubated them for 5 h to test their proliferation. Mononuclear cells from mice peripheral blood were collected and layered onto the support of the Ficoll-Hypaque solution. We added the thymocytes actively dividing (25 x 105 cells) from cultures stimulated with Cdc venom at 20 ng/well to cultured monocytes freshly obtained from the Ficoll-Hypaque separation. Both cell populations were incubated for 36 h until monocytes matured to macrophages. Results: The naïve thymocytes rapidly proliferated after stimulation with the Cdc venom (NTCdc) and these successively induced the maturation and function of monocytes progenitor cells to mature macrophages, which ingested Chinese ink. Conclusions: The naïve thymocytes proliferated by stimulation with the Cdc venom and subsequently the NT/Cdc induced the rapid maturation and function of monocytes progenitor cells becoming mature macrophages with their phenotypic characteristics.

Resumen. Introducción. El timo es activo principalmente durante los períodos neonatal y preadolescente. Objetivo. Probar la proliferación de los timocitos tempranos y la estimulación de monocitos que producen. Materiales y métodos. Se recogió tejido de timo fresco después de la cirugía de ratones recién nacidos. La suspensión de células se colocó sobre un soporte de Ficoll-Hypaque. Las células obtenidas (timocitos) se cultivaron y se midió la proliferación de células T vírgenes estimuladas por el veneno de Crotalus durissus cumanensis (Cdc) en dosis subletales (20 ng). A continuación, se agregó AlamarBlue™ a los pocillos y se incubaron durante 5 horas para evaluar la proliferación. Se recogieron células mononucleares de sangre periférica de ratones y se colocaron sobre un soporte de solución de Ficoll-Hypaque. Los timocitos que se dividieron activamente (25 x 105 células) a partir de los cultivos estimulados con veneno de Cdc (20 ng/pocillo) y se agregaron a los cultivos de monocitos recién obtenidos de la separación en la solución de Ficoll-Hypaque. Ambas poblaciones celulares se incubaron durante 36 horas hasta que los monocitos maduraron a macrófagos. Resultados Los timocitos tempranos experimentaron una rápida proliferación estimulada por el veneno de Cdc (NTCdc) y, posteriormente, indujeron la maduración y la función de las células progenitoras de monocitos, los cuales maduraron a macrófagos, que se tiñeron con tinta china. Conclusiones. Los timocitos tempranos proliferaron con la estimulación del veneno de Cdc y, posteriormente, el NT/Cdc indujo la maduración rápida y la función de las células progenitoras de monocitos, transformándose en macrófagos con sus características fenotípicas.

CX3CR1 regulates angiogenesis and activation of pro-angiogenic factors and triggers macrophage accumulation in experimental hepatopulmonary syndrome model.

OBJECTIVE: Prevalence of hepatopulmonary syndrome (HPS) ranges from 4% to 47% in patients with cirrhosis. This study aimed to explore possible relationship between CX3CR1 and angiogenesis or macrophage accumulation in pathological process of HPS. MATERIAL AND METHODS: Wide-type C57Bl/6 mice were divided into WT-sham, WT-common bile duct ligation (WT-CBDL), WT-CBDL plus antibody (WT-CBDL+Ab) and WT-CBDL plus Bevacizumab. The CX3CR1GFP/GFP mice were grouping into CX3CR1 GFP/GFP-sham, CX3CR1 GFP/GFP-CBDL and CX3CR1 GFP/GFP-CBDL+Bevacizumab group. Intrapulmonary expression of Akt, pAkt, ERK, pERK, iNOS, VEGF, PDGF was measured using biological technology. Hematoxylin-eosin (H&E) staining and immunohistochemical analysis were used to evaluate changes of pulmonary tissues including pathological abnormality, angiogenesis and macrophage accumulation. RESULTS: Blockade CX3CR1 pathway inhibited angiogenesis, macrophage accumulation and pathological changes of lung tissues. Blockade of CX3CR1 pathway reduced pAkt, pERK, iNOS, PDGF and VEGF activation. CX3CR1 contributed to the process of angiogenesis and activate the pro-angiogenic factors. CX3CR1 deficiency obviously reduced the macrophage accumulation. Inhibition of VEGF by Bevacizumab improved intrapulmonary angiogenesis and pathological changes of lung tissues. Inhibition of VEGF by Bevacizumab retarded the production of pAKt, PDGF, and iNOS. Inhibition of VEGF by Bevacizumab reduced CX3CL1 production. CONCLUSION: CX3CR1 could regulate the angiogenesis and activation of pro-angiogenic factors, including pAKT, pERK, iNOS, VEGF and PDGF in the process of hepato-pulmonary syndrome. Moreover, CX3CR1 could also contribute to the macrophage accumulation.

Avaliação in vitro e in vivo do potencial imunomodulador de frações polissacarídicas extraídas do chuchu / In vitro and in vivo evaluation of the immunomodulatory potential of polysaccharide fractions extracted from chayote

Os polissacarídeos não amido constituem importante parcela das fibras dietéticas, e podem ser considerados modificadores de resposta biológica (MRBs), uma vez que são capazes de interagir com o sistema imune, e suas características estruturais estão atreladas aos efeitos biológicos gerados. O potencial imunomodulador dos polissacarídeos do chuchu já foi demonstrado, entretanto, informações sobre suas características estruturais e sua relação com o perfil imunológico são limitadas a ensaios in vitro, não havendo, até o momento, estudos in vivo. Assim, o objetivo do estudo foi avaliar, in vitro e in vivo, o perfil imunomodulador de frações isoladas do polissacarídeo do chuchu. Por meio da filtração tangencial foram obtidas as frações de estudo, SeRI<50 e SeSE<50, respectivamente as frações isoladas do polissacarídeo do chuchu extraídas do resíduo insolúvel e do sobrenadante pós-tratamento enzimático para retirada do amido com peso molecular menor que 50 kDa. A caracterização por meio da determinação da composição monossacarídica e da análise de ligação apontou que ambas as frações são formadas por galacturonanos, arabinanos, arabinogalactanos e glicomananos. A SeRI<50 é menos ramificada e, provavelmente, composta por galactanos, enquanto SeSE<50 é mais ramificada e, provavelmente, composta por galactuglucomananos. Essas frações foram capazes de estimular os macrófagos murinos RAW 264.7 e as células mononucleares do baço, do sangue e do intestino delgado de camundongos Balb/c, sugerindo um perfil de ação mais pró-inflamatório, com base nos efeitos produzidos pelas espécies reativas de oxigênio, citocinas e pelos marcadores de ativação de linfócitos. Ambas as amostras, SeRI<50 e SeSE<50, mostraram ser eficientes em ativar a cascata imunológica, não sendo citotóxicas mesmo com a maior concentração testada no ensaio in vitro

Non-starch polysaccharides are important components of dietary fibers, and they may be considered biological response modifiers (MRBs), as they may interact with the immune system, depending on their structural characteristics. The immunomodulatory potential of chayote polysaccharides has already been demonstrated, however, information on their structural characteristics and their relationship with the immunological profile are limited to in vitro assays, with no reports on in vivo studies. Thus, the objective of the study was to evaluate, in vitro and in vivo, the immunomodulatory profile of polysaccharide from chayote. Through tangential filtration two fractions, SeRI <50 and SeSE <50, were obtained, respectively the fraction isolated from the chayote polysaccharide extracted from the insoluble residue and the fraction from the enzymatic post-treatment supernatant to remove starch, both under molecular weight 50 kDa. The monosaccharide composition and linkage analysis showed that both fractions are formed by galacturonans, arabinans, arabinogalactans and glycomanans. SeRI <50 is less branched and probably composed of galactans, while SeSE <50 is more branched and probably composed of galactuglucomannans. These fractions were able to stimulate murine macrophages RAW 264.7 and mononuclear cells of the spleen, blood and small intestine of Balb / c mice, suggesting a more proinflammatory action profile, based on the reactive oxygen species production, cytokines and lymphocyte activation markers. Both samples, SeRI <50 and SeSE <50, were able to efficiently activate the immunological cascade, not being cytotoxic even at the highest concentration tested in the in vitro assay